Primogenito dei quindici figli di Raniero dei marchesi del Monte Santa Maria (Perugia), dal 1543 conte di Monte Baroccio, Guidubaldo nasce a Pesaro nel 1545.
Inizia i suoi studi a corte con illustri coetanei, il principe Francesco Maria e Torquato Tasso.
Dopo il matrimonio con la figlia naturale di Guidubaldo Della Rovere e la nascita del figlio destinato a succedergli, si reca a Padova per affinare gli studi filosofici e scientifici.
I suoi studi gli danno presto celebrità: ha solo trentasette anni quando il Sansovino lo dichiara "uomo eccellentissirno nelle lettere e singolar matematico". Il suo Mechanicorum liber, pubblicato nel 1577, viene subito ristampato in traduzione volgare.
Tasso dedicherà all'amico d'infanzia il sonetto "Misurator de' gran celesti corpi".
E' questione non risolta se Guidubaldo sia stato dal duca Francesco Maria II scacciato di corte e obbligato a risiedere nel feudo. E' vero che negli anni 1600-1605 il conte risiede a Mombaroccio, probabilmente per dedicarsi agli studi, lontano dalla vita di corte.
L'aggravarsi di una malattia lo induce a ritornare a Pesaro, dove muore il 17 gennaio del 1607.
Guidubaldo divenne conte di Monte Baroccio alla morte del padre, nel 1587.
I vent'anni della sua signoria furono tra i più tormentati della storia italiana, afflitti tra l'altro da ripetute e gravissime carestie. Per fortuna di Mombaroccio e dei suoi signori, il declino della corte è controbilanciato dallo splendore crescente della corte romana del cardinale Francesco Maria, fratello di Guidubaldo, ricco e potente.
Del governo di Guidubaldo, le poche informazioni disponibili danno l'impressione di una presenza discreta e distaccata. Rare le sue interferenze negli affari della comunità, volte per lo più a sollecitare l'abbellimento del paese. Toccherà al figlio Francesco Maria farsi carico delle dissestate finanze della comunità che il dottissimo padre aveva lasciato piuttosto appesantite.

La fama e l'autorità di cui godette presso la comunità scientifica dell'epoca è provata anche dalle numerose lettere che Galileo gli scrisse per avere consensi e per ottenere protezione presso il fratello cardinale.
Oltre che di meccanica, Guidubaldo si occupò di cosmologia, di astronomia, di prospettiva, di balistica e quindi di architettura militare. Dei tanti figli, il solo Orazio raccolse l'eredità scientifica del padre, di cui pubblicò postumo il secondo trattato di astrologia. A lui, raccomandatogli dal padre, Galileo invierà nel 1610 copia del Sidereus Nuncius.