"L'Annunciazione" si trova nella parete sinistra della chiesa ed è sicuramente il dipinto più importante qui conservato. L'autore è ignoto ma non lo è l'ispiratore del dipinto, Federico Barocci, per la stessa divisione spaziale, lo stesso ambiente familiare, la stessa luce della giornata che scandisce i momenti della vita di Cristo (alba, annunciazione, tramonto, crocifissione).

Federico Barocci dipinge una Annunciazione per la Cappella di Francesco Maria II Della Rovere presso la chiesa di Loreto, cappella abbellita dagli scalpellini santippolitesi. E' proprio questo il legame tra il dipinto e l'autore urbinate che, in questo caso viene preso a modello da un artista che rivela una sua personalità formatasi su modelli culturali nordici. La scena è illuminata da una fredda luce che non produce ombre e che fa risaltare i toni neutri di grigio e i virtuosistici panneggi. La Madonna e l'Arcangelo Gabriele, che occupano la scena principale, sono affiancati da S.Francesco e, in primissimo piano, da un giovane personaggio riccamente vestito nel quale si può riconoscere Federico Ubaldo, unico figlio maschio dell'ultimo duca di Urbino Francesco Maria II, premorto al padre in giovanissima età. La prospettiva centrale è accentuata soprattutto nella resa dei visi e dei corpi che vanno ad assottigliarsi fino ad assumere caratterizzazioni quasi caricaturali.

Questi piccoli particolari ci rimandano al Manierismo nordico e quindi ci spingono a ricercare, tra i tanti autori d'oltralpe che lavorarono alla corte di Urbino, l'ignoto artista di questo interessante dipinto.